10.3760/cma.j.issn.1000-6680.2014.05.001
一种新乙型肝炎病毒表型耐药分析方法的建立
目的 建立一种新的、简便的HBV表型耐药分析方法,通过置换完整的反转录酶(RT)区研究药物敏感性.方法 首先全基因扩增未经核苷(酸)类似物治疗患者的HBV DNA,构建含HBV野毒株全基因组表达质粒PHY536207(B基因型)及PHY97(C基因型),继而在RT区上、下游设计限制酶切位点,改造后的质粒分别命名为mPHY536207及mPHY97.以CHB患者血清中分离到的拉米夫定(LAM)耐药变异株和阿德福韦酯(ADV)耐药变异株为骨架,分别构建LAM耐药株质粒PHY634和ADV耐药株质粒PHY6923,再用耐药株的RT区段取代mPHY536207中的RT区构建重组质粒,命名为RT634(LAM耐药)及RT6923(ADV耐药).分别用RT区置换前、后的质粒转染Huh7细胞,用ELISA法检测分泌到细胞上清液中的HBsAg水平,用实时PCR和Southern印迹法检测细胞内HBVDNA水平.结果 成功构建B型和C型野毒株表达质粒PHY536207和PHY97,经转染Huh7细胞证实有HBV复制能力,6孔细胞培养板中每孔细胞所抽提的HBV DNA均＞1×107拷贝/mL;在RT区上游设计的Pst Ⅰ酶切位点不影响HBV的表型(HBsAg的表达及HBV DNA的复制).在PHY634及RT634转染实验中,HBV DNA水平却并未随LAM浓度的升高而明显下降,50％抑制浓度(IC50)＞100 μmol/L,mPHY536207仅为0.18 μmol/L;PHY6923及RT6923转染实验中,HBV DNA对外加的ADV不敏感,IC50＞100 μmol/L,明显高于mPHY536207(1.2 μmol/L).结论 本研究建立了一种新的HBV表型耐药分析方法,可通过RT区置换来研究RT区变异对药物敏感性的影响.
肝炎病毒、乙型、RNA指导的DNA聚合酶、抗药性、表型
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R512.62;R34;R735.7
上海市卫生计生委项目20124466
2014-06-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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257-262
