10.3760/cma.j.issn.1000-6680.2012.06.002
HBsAg基因与细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4单链抗体的真核质粒载体构建及表达蛋白活性鉴定
目的 构建HBsAg基因(HBV S)与抗鼠细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)单链抗体(ScFv)的真核质粒载体,并检测融合表达蛋白特异性抗原的结合活性.方法 将CTLA-4单链抗体的真核表达质粒pSect2/ScFv4F10及含HBV S基因的质粒pSect2/S分别经SfiI和HindⅢ双酶切后,S基因片段进一步克隆至质粒pSect2/ScFv4F10中.将质粒pSect2/ScFv40、pSect2/S-ScFv4F10转染中华仓鼠卵巢细胞,Western印迹法检测目的蛋白的表达.将表达的蛋白经超滤浓缩与亲和层析纯化后,分别通过竞争抑制ELISA和表面等离子共振(SPR)技术,检测其与重组小鼠CTLA-4抗原的结合活性及亲合常数.采用One-way ANOVA比较组间差异.结果 成功构建可稳定表达S-ScFv4F10蛋白的真核质粒载体pSect2/S-ScFv4F10.十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western印迹法检测表明,其表达蛋白的相对分子质量约为52×103.当将抗鼠CTLA 4的亲本单链抗体4F10浓度固定时,其与CTLA-4纯化抗原混合反应的吸光度(A)570值随ScFv融合蛋白比例的减少而逐步增大;且当ScFv、S-ScFv4F10与4F10单链抗体以摩尔比为2∶1混合时,其对4F10结合抗原的竞争抑制率分别可达到72.6％和64.5％;亲本单链抗体、ScFv4F10、S-ScFv4n0与重组CTLA-4抗原的结合平衡常数KA值分别为7.29×108mol/L、9.52×106mol/L和2.04×106mol/L,解离平衡常数KD分别为1.40×10-9mol/L、1.05×10-7mol/L和4.91×10-7mol/L.结论 成功构建了HBV S基因与CTLA-4单链抗体ScFv4F10的真核表达质粒载体pSect2/S-ScFv4F10,其表达的蛋白与CTLA-4抗原具有一定的亲和活性.
基因、病毒、肝炎表面抗原、乙型、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原、基因表达、质粒、免疫活性
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R581(内分泌腺疾病及代谢病)
国家自然科学基金资助项目30901267;国家"十一五"重大专项资助项目0082X10002-007
2012-09-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
324-329
