10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.002
基于CRISPR/Cas9系统的水稻光敏色素互作因子OsPIL15基因编辑
[目的]光作为一种环境信号,可影响植物的基因表达、酶活性和形态建成.光敏色素互作因子在光信号传导过程中起着重要作用.本研究旨在构建水稻光敏色素互作因子0sPIL15的CRISPR/Cas9表达载体,创制OsPIL15突变体,挖掘水稻功能基因,丰富和完善水稻光信号调控分子机制.[方法]依据CRISPR/Cas9技术原理,设计0sPIL15突变靶点.将所设计靶序列在水稻基因组中进行比对,排除非特异性靶位点,同时使该靶序列含有常用酶切位点,方便后期突变体鉴定.化学合成靶位点寡核苷酸序列并与载体pBUN411连接构建CRISPR/Cas9表达载体,利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本睛,以除草剂抗性标记筛选获得阳性转基因植株.利用酶切法判断T0代转基因植株是否发生突变,结合测序结果分析突变单株的突变基因型.将靶点序列在水稻全基因组中进行比对分析,选择5个与靶序列同源性较高且错配在4 bp以内的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估,分析所设计靶序列特异性.[结果]所构建表达载体成功实现了对OsPIL15的定向编辑,酶切显示在选取的25株T0代转基因植株中获得15株突变体,其中包括5株纯合突变体、6株双等位突变体和4株杂合突变体,共10种不同突变基因型和11个突变株系.突变类型以单碱基插入或缺失为主,同时也得到2种56和66 bp较大片段缺失株系.对部分纯合突变、双等位突变和杂合突变体的T1代植株进行分析,结果表明,T0代产生的突变基因型绝大部分能稳定遗传给下一代.T0代纯合突变体后代为纯合突变单株,仅在株系14纯合突变体后代中检测到1株未突变单株;T0代双等位突变体后代可得到2种纯合突变型和1种双等位突变型;T0代杂合突变体后代则可得到纯合、杂合及未突变3种类型.对T0代未突变植株的后继世代酶切分析显示,62株T1代转基因植株均未发生突变,表明CRISPR/Cas9在T1代转基因阳性植株中未重新发挥基因编辑作用.对20株突变体的5个潜在脱靶位点进行分析,5个潜在脱靶位点均未检测出脱靶效应,表明所设计靶序列具有较高特异性.对选取的3组不同基因型ospil15T1代突变体表型进行初步观察,结果表明,突变体生育期和分蘖数未出现明显变化,株高极显著下降,籽粒粒长极显著增加,最大增幅达5.69％.[结论]CRISPR/Cas9系统能对OsPIL15进行定向编辑,获得的10种不同突变基因型的ospil15突变体与野生型相比株高极显著降低、籽粒粒长极显著增大.
水稻、CRISPR/Cas9、基因编辑、OsPIL15、脱靶效应
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S60;S63
河南省重大科技专项141100110600;河南省高等学校重点科研项目16A210026
2017-11-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共11页
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