10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.007
锯角豆芫菁法尼基焦磷酸合酶的cDNA克隆、序列分析及原核表达
[目的]法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase,FPPS)是单萜和倍半萜生物合成途径分支点的关键酶,获得芫菁法尼基焦磷酸合酶基因(FPPS)是探究其与斑蝥素生物合成途径关系的基础.论文旨在克隆锯角豆芫菁(Epicauta gorhami Marseul)FPPS,预测该基因及其编码蛋白的结构、性质与功能,并实现其编码蛋白的原核表达.[方法]首先根据已知昆虫FPPS编码蛋白的保守区序列,利用CODEHOP软件设计简并引物,利用RT-PCR获得锯角豆芫菁的cDNA模板,巢式PCR扩增锯角豆芜菁FPPS保守区;随后根据所得的保守区片段设计特异性引物,运用RACE技术分别克隆锯角豆芫菁FPPS3'和5'端序列;然后根据预测的FPPS开放阅读框(ORF)设计ORF区特异性引物,巢式PCR扩增编码区序列;最后用DNAMAN拼接获得锯角豆芫菁的全长cDNA序列.运用DNAMAN、MEGA 5.05、ProtParam及TargetP 1.1 Server等多种生物信息学软件对该基因全长cDNA序列、Fps系统进化关系及其基本理化性质、FPPS蛋白的亚细胞定位等进行分析;将锯角豆芫菁FPPS与pET28a(+)连接,构建原核表达载体pET28a(+)-EgFPPS并将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,IPTG诱导融合蛋白的原核表达.分别收集不同诱导时间段的菌液,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况.将高效表达时段收集的菌液超声波破碎后,分离上清及沉淀并进行煮沸处理,SDS-PAGE检测融合蛋白的可溶性;Western Blot印迹杂交验证目的蛋白的表达.[结果]获得锯角豆芫菁法尼基焦磷酸合酶基因FPPS全长eDNA序列,命名为EgFPPS (GenBank登录号KC840040),序列分析结果表明,该基因全长1 857 bp,其中5啡编码区146 bp,3'非编码区436 bp,开放阅读框1 275 bp,共编码424个氨基酸,其编码的蛋白分子质量约为49.2 kD,理论等电点pI为8.89,预测分子式为C2192H3457N605O632S25,不稳定系数为38.62,总平均亲水系数为-0.429,为疏水的稳定蛋白.序列分析发现,锯角豆芫菁与其他6种昆虫FPPS在氨基酸水平上具有72.56％的同源性,且其近N端具有R**S四肽基序,此外还包含7个异戊烯基转移酶保守区和两个典型的DD**D的天冬氨酸富含区.系统发育树显示锯角豆芫菁与鞘翅目拟步甲科昆虫赤拟谷盗进化关系最近.EgFPPS的亚细胞定位进行预测发现其N端具有一段明显的线粒体靶向肽.原核表达结果表明,该蛋白在终浓度为1 mmol.L-1的IPTG诱导4h即能实现融合蛋白的高效表达;融合蛋白的可溶性检测表明该蛋白主要以包涵体的形式存在;Western Blot印迹检测也证实大肠杆菌DE3中表达了一个分子量约为49 kD的蛋白质,与预测分子量大小基本一致.[结论]成功从芫菁科昆虫克隆得到FPPS,并成功实现了其编码蛋白的原核表达,为后期探索其在芜菁科昆虫体内斑蝥素生物合成途径中的功能提供理论基础.
锯角豆芫菁、FPPS、RACE技术、生物信息学、原核表达
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国家公益性行业农业科研专项200905032;陕西省“13115”科技创新工程重大科技专项2007ZDKG-14;高校基本科研业务费QN2013010
2014-05-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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