粉尘螨变应原Der f 8全长基因克隆及表达
目的 获得粉尘螨(Dermatophagoides farinae)变应原Der f 8全长基因并构建其原核表达质粒.方法 参考GenBank登录号为AY283295的Der f8部分序列设计并合成引物.以粉尘螨总RNA为模板,RT-PCR扩增获得Der f 8部分片段.采用5'cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得Der f 8全长序列,连接至pMD19-T载体,热转化至大肠埃希菌(Escherichia coli),挑取阳性菌落,抽提质粒后测序.根据Der f 8全长序列设计并合成引物,以粉尘螨总RNA为模板进行RT-PCR扩增,产物回收后连接pCold TF载体,热转化至E.coli涂板过夜培养后,挑取阳性菌落,抽提质粒后测序.将pCold TF-Der f 8质粒转化至E.coliBL21,异丙基-3-D-硫代半乳糖苷诱导表达,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物.采用生物信息学软件预测Derf 8的理化特性、结构和功能,并构建系统进化树.结果 以Der f 8部分序列设计的引物行RT-PCR扩增获得Der f 8部分片段,长度为600bp;5'RACE获得Der f 8剩余序列,长度为300 bp;以全长基因序列设计的引物进行RT-PCR扩增获得了Der f 8基因CDS区,长度为696 bp,测序均正确.SDS-PAGE结果显示,目的蛋白为可溶性表达,相对分子质量(Mr)为81 000,与预期大小一致.序列经生物信息学分析结果显示,Der f 8全长序列与参考序列(GenBank登录号为AY283295)同源性为98.49％,预测其编码的疏水性蛋白具有谷胱甘肽S转移酶活性,二级结构包括α-螺旋(45.45％)、延伸主链(11.26％)和无规卷曲(43.29％).系统进化树结果显示,粉尘螨与户尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)聚成一簇. 结论 获得了Der f 8全长基因及其原核表达质粒.
粉尘螨、变应原、基因克隆、基因表达、生物信息学
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R384.429(医学寄生虫学)
国家自然科学基金NSFC31272369,NSFC81001330,NSFC30060166,NSFC31572319;江苏省卫生厅招标项目Z200914;江苏省卫生职业技术教育研究立项课题No.J200907Supported by the National Natural Science Foundation of ChinaNSFC31272369,NSFC81001330,NSFC30060166,NSFC31572319;Jiangsu Province Health Department Project Subject to TenderZ200914;Jiangsu Province Health Vocational and Technical Education Research Project TopicsJ200907
2017-11-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共6页
351-356
