刚地弓形虫RH株ROP18-ROP12复合基因真核表达载体的构建
目的 构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白18 (ROP18)与ROP12的复合基因真核表达重组质粒,并检验其在真核细胞中的表达情况. 方法 重组质粒pVAX 1-ROP18和pVAX1-ROP12分别经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切,将ROP12基因克隆至pVAX1-ROP18重组质粒.经菌落PCR、酶切及测序鉴定正确的重组表达质粒pVAX 1-ROP18-ROP12转染至HeLa细胞.同时设空质粒组、pVAX1-ROP18转染组和pVAX1-ROP12转染组.提取各组HeLa细胞的总RNA并逆转录为cDNA,分别进行管家基因β-肌动蛋白和ROP18-ROP12复合基因的RT-PCR鉴定;同时,采用间接荧光免疫法和蛋白质印迹(Western blotting)法检测重组质粒pVAX1-ROP18-ROP12瞬时转染HeLa细胞后蛋白的表达情况. 结果重组质粒pVAX 1-ROP18-ROP12的菌落PCR电泳显示在约2 373 bp处出现特异性扩增片段,与预期大小相符.提取重组质粒经HindⅢ、BamH Ⅰ和XbaⅠ单酶切、双酶切及三酶切鉴定均正确.测序结果显示,pVAX 1-ROP18-ROP 12重组质粒与已发表的弓形虫RH株ROP18基因(登录号为AM075204.1)序列一致性为100％,与弓形虫RH株ROP12基因(登录号为DQ096559.1)序列一致性为99％.脂质体转染后各组β-肌动蛋白的RT-PCR扩增产物均为613 bp,与预期大小相符.pVAX1-ROP18-ROP12转染组的ROP18-ROP12复合基因扩增产物大小为2 373 bp,而其他组未见条带.间接荧光法检测显示,在重组质粒转染的HeLa细胞胞浆中观察到黄绿色荧光,而对照组无黄绿色荧光.Western blotting法检测显示,融合蛋白ROP18-ROP12相对分子质量(Mr)约为85 000. 结论构建了重组质粒pVAX1-ROP18-ROP12,该质粒能在真核细胞中表达.
刚地弓形虫、棒状体蛋白18、棒状体蛋白12、复合重组质粒、真核表达
33
R382.5(医学寄生虫学)
Supported by Hebei Province Natural Science Fund No.H2013405091,the Key Research Projects of Hebei Higher School Science and Technology No.ZH2012010,and the Major Issue of Hebei North University No.ZD201312 河北省自然科学基金项目No.H2013405091;河北省高等学校科学技术研究重点项目No.ZH2012010;河北北方学院校级重大课题No.ZD201312
2015-07-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
161-166
