湖北钉螺硫氧还蛋白过氧化物酶全长基因克隆、表达与蛋白活性分析
目的 克隆湖北钉螺(Oncomelania hupensis)硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx)全长基因cDNA,并分析其表达蛋白的抗氧化活性. 方法 抽提人工饲养的阴性湖北钉螺总RNA,采用逆转录PCR方法扩增TPx基因片段.使用快速扩增cDNA末端法(RACE)扩增TPx基因,获得全长基因cDNA,与质粒pGEM-Teasy连接后,转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,筛选、测序,并进行生物信息学分析.克隆质粒pGEM-Teasy/TPx和表达载体pET28a经双酶切后连接,构建重组表达质粒pET28a/TPx,转入E.coli BL21 (DE3),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,通过组蛋白标签镍离子(Ni-NTA)层析柱分离纯化可溶性蛋白.在体外过氧化氢(H2O2)还原试验中,分别加入不同浓度的TPx重组蛋白(10、20、30、40和50μg/ml),各浓度均设二硫苏糖醇(DTT)平行对照,计算H2O2清除率.在DNA超螺旋保护试验中,分别加入2.5、5.0和10 μg/ml重组蛋白,观察其对DNA超螺旋结构的保护作用. 结果 TPx全长基因cDNA为992 bp,开放阅读框(ORF)为747 bp,GenBank登录号为JN831437,编码249个氨基酸,预期蛋白相对分子质量(Mr)为27000.重组质粒pET28a/TPx构建成功,经诱导表达和纯化后获得了可溶性重组蛋白.SDS-PAGE结果显示,Mr为27000.体外H2O2还原试验结果显示,含有DTT的反应体系H2O2清除率均显著高于不含DTT的体系(均P＜0.05),各个浓度组间差异无统计学意义(均P＞0.05).DNA超螺旋保护试验结果显示,5.0μg/ml组保护效果优于2.5 μg/ml组,但5.0μg/ml组和10 μg/ml组的保护效果差异不明显.结论 获得湖北钉螺TPx全长基因cDNA,且重组表达蛋白具有一定抗氧化功能.
湖北钉螺、硫氧还蛋白过氧化物酶、克隆、表达
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R383.241(医学寄生虫学)
国家传染病科技重大专项2012ZX10004220;上海市自然科学基金10ZR1433400
2012-12-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
262-267
