GST沉降技术验证弓形虫醛缩酶与肌动蛋白的相互作用
目的 通过GST沉降技术(GST pull-down)验证刚地弓形虫醛缩酶(aldolase)与肌动蛋白(actin)的相互作用. 方法 PCR扩增弓形虫cDNA中aldolase和actin基因,分别亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1和pET30a,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,亲和层析法纯化表达产物.采用腹部皮内多点注射免疫SD大鼠15只,首次免疫Actin-His6蛋白量为200μg/只,第2次起免疫蛋白量为100μg/只,共免疫4次,每次间隔7d,末次免疫后5d收集心脏血,制备Actin-His6抗血清.以纯化的GST-Aldolase蛋白作为探针蛋白与Actin-His6蛋白液进行GST沉降实验,实验产物进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析. 结果 获得了弓形虫aldolase和actin基因序列,构建了相应的原核表达载体.表达并纯化了GST-Aldolase和Actin-His6蛋白.Actin-His6蛋白免疫SD大鼠后获得其抗血清,经抗体亲和纯化柱纯化,获得Actin-His6多克隆抗体.SDS-PAGE和Western blotting结果显示,GST沉降实验产物中的蛋白条带可被Aldolase-His6多克隆抗体和Actin-His6多克隆抗体识别.结论 弓形虫醛缩酶与肌动蛋白存在相互作用.
刚地弓形虫、醛缩酶、肌动蛋白、GST沉降技术、蛋白相互作用
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R382.5(医学寄生虫学)
新乡医学院博士科研启动基金2010
2012-03-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
363-367
