10.3760/cma.j.issn.2095-0160.2016.06.002
无动物源性成分培养体系快速诱导人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化
背景 随着视网膜色素上皮(RPE)细胞视网膜下腔移植治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)研究的开展,需要优化无动物源性成分(xeno-free)培养体系快速定向诱导人胚胎干细胞(hESCs)向RPE细胞分化以满足日渐增长的科研及临床需要. 目的 建立xeno-free培养体系,优化快速诱导hESCs向RPE细胞分化的方法. 方法 将hESCs克隆团接种至Vitronectin XFTM,在培养液中加入50 ng/ml noggin、10 ng/ml DKK-1以及10 ng/ml胰岛素样生长因子-1(IGF-1)培养2d,第2～4天将培养液中noggin质量浓度减至10 ng/ml,并加入5 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),第4～6天移除培养液中的noggin和bFGF,第8～14天培养液中加入1 μmol/L CHIR99021.倒置显微镜下观察ESCs在分化为RPE细胞过程中的形态变化,免疫荧光染色检测细胞内特异性抗原的表达以对分化细胞进行鉴定,实时荧光定量PCR (qRT-PCR)法检测细胞分化过程中RPE细胞特异性蛋白mRNA的相对表达变化量.结果 分化培养第14天,部分细胞呈多角形并呈现铺路石样排列,且细胞内可见色素颗粒;培养第35天,诱导分化的细胞内表达RPE细胞特异性抗原Mitf及RPE65;培养至第60天,细胞内富含黑色素颗粒且呈规则六边形.与诱导分化前比较,诱导分化第7天和第14天hES-RPE细胞中Mitf mRNA的表达量分别增加了(3.43±2.77)倍和(8.91±2.83)倍,而RPE65 mRNA的表达量分别增加了(14.60±3.94)倍和(87.16±9.32)倍,分化第7天和第14天细胞中的Mitf mRNA和RPE65mRNA的相对表达量均明显高于分化前,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 hESCs可在含尼克酰胺、DKK-1、noggin、IGF-1和CHIR99021的xeno-free优化培养体系中快速分化为RPE细胞.
胚胎干细胞/药物作用、细胞培养技术/方法、细胞分化、视网膜色素上皮、培养液/药物作用、细胞株、人、无动物源性
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国家重点基础研究发展计划973项目2013CB967004;国家自然科学基金项目81371020National Program on Key Basic Research Project 973 Program2013CB967004;National Natural Science Foundation of China81371020
2016-07-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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