10.3321/j.issn:0577-7402.2009.03.021
Galectin-1 RNAi载体构建及其稳定转染LST-R1细胞系的建立
目的 构建galectin-1基因特异小分子干扰RNA(siRNAs)真核干扰载体,并获得干扰载体稳定转染的LST-R1细胞系.方法 设计2对galectin-1 mRNA(GenBank:NM002305)特异性siRNAs,两端分别带有BamH I/Hind Ⅲ酶切位点和一个9nt的发夹结构,通过基因克隆技术将其插入真核表达质粒pSUPgR-puro中,构建galectirt-1 siRNA表达载体,以EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切及测序验证重组载体的正确性.将重组载体与pcDNA6/TR共转染LST-R1细胞,以嘌呤霉素(0.8μg/ml)进行阳性克隆筛选.四环素(4μg/ml)诱导48h后,RT-PCR检测galectin-1 mRNA表达水平,Western blotting和细胞免疫化学方法检测galectin-1蛋白质水平的变化.结果 测序表明galectin-1 siRNA真核表达载体p-shRNA1和p-shRNA2干扰序列与读码框相符.p-shNRA1和p-shRNA2与pcDNA6/TR共转染LST-R1细胞,获得稳定的重组质粒转染细胞p-shRNA1-LST和p-shRNA2-LST.RT-PCR显示,galectin-1 mR-NA在LST-R1细胞、p-shRNA1-LST细胞、p-shRNA2-LST细胞以及p-LST细胞中的表达量分别为0.616、0.298、0.373和0.641,以p-shRNA1-LST的干扰效果最好.Western blotting结果显示,在LST-R1、p-shRNA1-LST、p-shRNA2-LST和p-LST细胞中galectin-1的表达量分别为1.00、0.07、0.38和0.97,以p-shRNA1-LST干扰效果最好,与免疫细胞化学的结果一致.结论 成功构建了galectin-1真核干扰载体,RNAi载体转染LST-R1细胞系的建立为进一步研究galectin-1在大肠侧向扩散型肿瘤中的作用奠定了实验基础.
结直肠肿瘤、半乳糖结合蛋白、RNA干扰、细胞系、转化
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R735.34(肿瘤学)
2009-04-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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