10.16085/j.issn.1000-6613.2019-1727
盖子环替换及定点突变提高菜豆环氧化物水解酶对邻甲基苯基 缩水甘油醚的催化性能
菜豆环氧化物水解酶1和2(PvEH1、PvEH2)能够动力学拆分外消旋邻甲基苯基缩水甘油醚(rac-oMGE),从而保留(R)-oMGE.基于对PvEH1和PvEH2结构的同源模拟和分析,发现二者分子中的盖子环差异较大,故本文选择盖子环作为研究目标.经融合聚合酶链式反应(FPCR),获得了PvEH2的盖子环区域被PvEH1对应区域替换的杂合酶Pv2Pv1.用全细胞酶E.coli/pv2pv1催化rac-oMGE,当(S)-oMGE刚好水解完全时,产物(S)-3-邻甲苯基-1,2-丙二醇((S)-oTPD)的eep由PvEH2的58.3%提高至75.5%.为进一步提高酶的性质,在Pv2Pv1中选取11个氨基酸位点进行丙氨酸(A)突变,获得最优突变子E.coli/pv2pv1K176A,活性为E.coli/pv2pv1(4.2U/g)的2.1倍,且当S构型的底物刚好完全水解时,(S)-oTPD的eep进一步提高为80.3%.分子对接分析发现,盖子环替换和K176位点突变为A,均使(R)-oMGE环氧环中的Cα更易受到酶中D101位点的攻击.利用E.coli/pv2pv1K176A催化150mmol/L rac-oMGE水解制备(R)-oMGE(ees>99%)和(S)-oTPD(eep=80.4%),二者的产率YS和YP分别为32.7%和60.1%,时空产率STYS和STYP为1.6g/(L·h)和3.3g/(L·h).本实验为改善EH的催化性质提供了一种有效策略.
菜豆环氧化物水解酶、邻甲基苯基缩水甘油醚、盖子环、丙氨酸突变、分子对接
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TH3(泵)
国家自然科学基金21676117
2020-07-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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2788-2794
